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Introdução

A indústria enológica está constantemente buscando linhagens de leveduras que possibilitem um desenvolvimento ótimo no processo de fermentação. O isolamento de linhagens autóctones de Saccharomyces cerevisiae é uma opção muito favorável, pois agrega a eficiência do uso de linhagens selecionadas com a diversidade da microbiota autóctone (Belda ,2014).

A Coleção de Microrganismos de Interesse Agroindustrial (CMIA) é uma coleção de leveduras e fungos filamentosos abrigada pelo Laboratório de Microbiologia Aplicada (LMA) da Embrapa Uva e Vinho, localizada em Bento Gonçalves- RS, e conta com mais de 4800 linhagens de leveduras de diferentes espécies. A maior parte da coleção, cerca de 90%, é oriunda de isolamentos de leveduras provenientes de uvas, de diferentes regiões brasileiras, constituindo um importante patrimônio da biodiversidade brasileira.

A composição aromática é um indicador utilizado para avaliar a qualidade do vinho e um fator importante que influencia a intenção de compra dos consumidores. O aroma complexo e equilibrado determina a aceitação de vinho comercial no mercado. Já foram identificados mais de 1000 componentes de aroma, incluindo principalmente álcool, ésteres, ácidos orgânicos e terpenos em concentrações que variam de mg.L^-1 a ng.L-1 (Bezus et al., 2023; Zhang et al., 2021).

Atualmente, a liberação de aroma é aprimorada usando preparações enzimáticas de origem fúngica, principalmente Aspergillus spp. A composição dessas preparações varia, mas geralmente são misturas de enzimas não específicas, o que pode desencadear reações colaterais de hidrólise prejudiciais ao produto além de diminuir a tipicidade do vinho (Bezus et al., 2023; de Ovalle; Brena; González-Pombo, 2021).

Alguns compostos precursores de aromas são encontrados na forma não volátil, ligados à glicosídeos. Após uma sequência de hidrólises enzimáticas, tornam-se voláteis e, assim, perceptíveis sensorialmente. A β-glucosidase é uma enzima importante no processo de vinificação, pois contribui para a hidrólise de diferentes tipos de ligações glicosídicas, tais como ligações 1,4-β, promovendo a formação de terpenos livres, fenil propenos e ésteres alifáticos específicos durante a fermentação do vinho. Além disso, a β-glucosidase também modifica a composição dos compostos fenólicos, influenciando a concentração final de resveratrol e antocianinas no vinho (Rompkovksi et al., 2022; Zhang et al., 2021).

Os substratos arbutin e esculin são considerados os compostos análogos β- glicosídicos da uva mais confiáveis, por isso bastante usados nas pesquisas qualitativas in vitro de enzimas β-glucosidase (Perez et al, 2011).

Metodologia

Reativação de leveduras e preparo das suspensões de células

As leveduras foram retiradas do ultrafreezer (-80°C) e semeadas em placas ou tubos com meio YEPD e colocadas para crescimento em estufa a 28°C. Após crescimento satisfatório foram preparadas suspensões em água estéril com cerca de 10⁷ células/mL. A concentração foi verificada através do uso do cartão de Wickerham. (LENETTE et al, 1985).

Teste Qualitativo de Produção de β-glucosidase

A produção de enzima foi avaliada conforme a capacidade das leveduras em utilizar o substrato arbutin como fonte de carbono. Para o teste, foram alíquotados  25 mL do meio de cultura YNB 6,7gL^-1 e colocados em erlenmeyer, adicionados de arbutin 0,75 g.L^-1, realizada a correção para pH 5,5 e esterilizados em autoclave a 121°C por 30 minutos. Após autoclavagem, 1mL de citrato férrico 0,1 g.L^-1 (previamente esterilizado) foi adicionado sob fluxo laminar. Em seguida, 200µL de suspensão das leveduras foram adicionados individualmente aos erlenmeyers.  A leitura positiva/negativo foi realizada pela mudança de cor, após passados 7 dias em agitador-incubador a 150 rpm e 28°C. As amostras positivas passavam a apresentar coloração marrom.

 

Figura 1: Preparo do teste de produção de β-glucosidase

Resultados e Discussão

Foram selecionadas da Coleção CMIA 70 linhagens de leveduras Saccharomyces cerevisiae que foram reativadas e testadas quanto à produção de β-glucosidase em bateladas de 20 amostras com um controle positivo em todas elas.

 

 

 

 

 

 

 

Figura 2: Leitura do resultado positivo para produção de β-glucosidase.

 

 

Número de linhagens

Nível de cor marrom

60

0

1

1

1

2

8

3

Tabela 1: Número de linhagens para cada nível de cor marrom

 

Foi observado variações de intensidade de cor marrom nos resultados das avaliações, por isso as amostras positivas foram separadas em 3 grupos, sendo o número 1 para as amostras mais claras e 3 para as amostras mais escuras.

Das 70 linhagens avaliadas, 10 apresentaram resultado positivo para a produção de β-glucosidase em algum nível, resultando em um percentual de 14,3 % de linhagens positivas. O resultado foi inferior ao encontrado por Gaensly (2015), que obteve 45,5 % de linhagens com resultado positivo para a produção de enzim. Porém foi bem superior ao encontrado por Rosi, Vinella e Domizio (1994) que foi de 0,65 % de linhagens Saccharomyces cerevisiae produtoras de β-glucosidase.

 

Considerações finais

O uso de leveduras autóctones produtoras de β-glucosidase pode trazer diversas vantagens ao setor vinícola nacional, podendo agregar tipicidade e qualidade aos produtos. O trabalho obteve como resultado a identificação de 10 linhagens autóctones de Saccharomyces cerevisiae produtoras da enzima β-glucosidase que podem potencialmente vir a ser utilizadas pela indústria na aprimoração de aromas dos vinhos brasileiros.

β-glucosidase, Aroma, Leveduras Autóctones