A enzima β-galactosidase (lactase) é responsável pela hidrólise do dissacarídeo lactose, resultando em seus constituintes monossacarídeos glicose e galactose. É amplamente explorada na indústria alimentícia, para produção de leite e derivados com baixo teor de lactose, assim como na indústria farmacêutica, devido a crescente demanda de pessoas intolerantes a lactose. As β-galactosidases podem ser produzidas por microrganismos, estes são as principais fontes de obtenção da enzima para utilização industrial. Através da técnica do DNA recombinante, a expressão em Escherichia coli da β-galactosidase de Kluyveromyces surge como alternativa inovadora de otimização do processo produtivo. Esta técnica, assim como diversos processos biotecnológicos, envolve a necessidade da purificação do bioproduto de interesse. O objetivo do presente trabalho foi determinar as condições de purificação da enzima recombinante β-galactosidase, testando e avaliando a eficiência de diferentes técnicas. Cepas de E. coli recombinante BL21(DE3) transformadas com o gene que codifica a β-galactosidase de Kluyveromyces sp., foram cultivadas em batelada alimentada, em biorreator de 2 L em condições previamente determinadas. As células cultivadas foram resuspendidas em tampão TRIS HCl 50mM pH 7,5 (Tp-THCl), rompidas por pressão (Prensa de French) e a fração solúvel (extrato enzimático) foi recolhida. Esta fração passou por uma etapa de clarificação, através de centrifugação (13000 rpm, 10 min, 4°C) e por uma etapa de precipitação do DNA utilizando sulfato de estreptomicina 1%. A fração solúvel foi então dialisada em Tp-THCl. Com a amostra, livre de DNA, foram testadas as técnicas de purificação de troca aniônica, utilizando as colunas cromatográficas Q XL HiPrep e Q HP HiPrep, e de interação hidrofóbica, utilizando a coluna Source 15Phe, respectivamente, em sistema ÄKTA Purifier (GE Health Care). Entre cada etapa cromatográfica a amostra foi dialisada com Tp-THCl e tratada com sulfato de amônio 750 mM para aplicação na coluna de interação hidrofóbica. A avaliação da eficiência das técnicas testadas ocorreu pela análise da concentração de proteína, através de diferentes cumprimentos de onda, durante o processo de purificação; expressão da β-galactosidase, utilizando eletroforese vertical em géis de poliacrilamida 12 %; quantificação de proteínas, através do método de Bradford; e determinação da atividade da enzima β-galactosidase utilizando ONPG (o-nitrofenol-β-D-galactopiranoside) como substrato. A melhor separação, concentração da enzima e o maior rendimento do processo (aproximadamente 50%), foram observados utilizando apenas a coluna cromatográfica Q HP HiPrep. Não houve a purificação total da β-galactosidase mas, em todas as técnicas testadas, a proteína foi expressa em grande quantidade e manteve atividade enzimática.