Entre os tipos de câncer mais incidentes em mulheres, destaca-se o câncer de colo de útero, que ocupa atualmente a quarta posição no ranking mundial. No Brasil, são estimados 16.370 novos casos para o ano de 2019 e as terapias disponíveis atualmente carecem de seletividade e efetividade. Espécies vegetais constituem fontes de moléculas bioativas que podem ser utilizadas na prospecção de novas alternativas terapêuticas. Diversas atividades biológicas já foram descritas para extratos provenientes de espécies vegetais pertencentes à família Piperaceae, como propriedades antimicrobianas, antifúngicas, antiparasitárias e antiinflamatórias. Dessa forma, o objetivo do presente trabalho é avaliar a composição química e efeito biológico do óleo volátil extraído a partir de folhas da espécie Piper regnellii (Miq.) C. DC em células de câncer de colo uterino humano. Para tanto, o óleo essencial foi extraído por hidrodestilação em Clevenger e analisado em cromatógrafo a gás associado a detector de massas (CG-EM). As células da linhagem de câncer de colo uterino humano (SiHa) e a de queratinócitos humanos imortalizados (HaCaT) foram cultivadas em meio DMEM, suplementado com 10% de soro fetal bovino e mantidas sob condições padrão (37ºC e 5% de CO2). Para verificação do efeito do óleo essencial sobre a viabilidade celular, as duas linhagens foram submetidas a tratamentos com concentrações crescentes do óleo essencial (0,01 a 5 µg/mL) e de veículo por 24 horas, seguido de ensaio de MTT (0,5 mg/mL). Também foi avaliado o efeito da concentração inibitória média (IC50) do óleo essencial sobre a capacidade de formação de colônias e de migração das células tumorais, por meio dos ensaios clonogênico e wound healing, respectivamente. Após 24 horas de tratamento, foram alcançados percentuais de inibição da linhagem de câncer cervical de até 89% e IC50 de 0,20 µg/mL. O óleo exerceu efeito sobre a viabilidade da linhagem não-tumoral em menores proporções e IC50 de 0,75 µg/mL, resultando em um índice de seletividade adequado (3,5). A capacidade de formação de colônias das células tumorais foi diminuída em 43% e a largura da ruptura induzida na monocamada celular  após o tratamento foi em média 25% maior em relação ao controle, evidenciando uma diminuição na capacidade de migração. Dessa forma, o óleo estudado pode representar uma fonte de moléculas bioativas com atividade positiva sobre células de câncer cervical, sendo adequada a continuidade dos estudos que visem avaliar seu efeito sobre outros parâmetros biológicos importantes para o estabelecimento, manutenção e agressividade das células tumorais.