A β-galactosidase tem especial importância para a indústria, sendo utilizada na preparação de produtos lácteos utilizados por indivíduos intolerantes a lactose. Uma etapa fundamental na produção da β-galactosidase recombinante, envolve a expressão desta enzima, que pode ser realizada por diferentes indutores.  Portanto, o objetivo deste trabalho foi verificar a eficiência de diferentes indutores e suas concentrações na expressão da enzima β-galactosidase de Kluyveromyces sp. em Escherichia coli. Células de E. coli BL21 (DE3) foram transformadas por eletroporação com o DNA da construção pET30a(+):β-galactosidase, previamente realizada. Os cultivos da E. coli BL21 (DE3) contendo a transformação foram realizados em 50 mL de meio Luria-Bertani (LB), na presença do antibiótico canamicina, sendo mantidas em agitação orbital de 180 rpm, a 30 ºC. Foram adicionados a cada cultivo 10 % de pré-inóculo padronizado com densidade óptica (OD) de 0,1 a 600 nm. Os cultivos foram induzidos ao atingirem OD entre 0,4 e 0,6. Para realizar a indução foram testados os indutores IPTG (isopropil-β-D-1-tiogalactosídeo) nas concentrações de 0,05 mM e 0,5 mM, e lactose nas concentrações 1 g/L, 10 g/L e 20 g/L. Os cultivos foram realizados em triplicatas e foram coletadas amostras em diferentes tempos após a indução (3 h, 6 h, 9 h, 24 h e 27 h). Para controle também foram realizados cultivos não induzidos e de células transformadas apenas com o vetor de clonagem (sem o gene de interesse), induzidas e não induzidas. As amostras coletadas foram centrifugadas a 13.000 rpm por dois minutos, retirado o sobrenadante e o pellet de células foi ressuspendido, rompido por sonicação e as frações separadas por centrifugação. A expressão da β-galactosidase foi analisada nas frações solúveis e insolúveis, por meio de SDS-PAGE, utilizando Comassie Brilliant Blue como corante. A quantificação da proteína solúvel intracelular foi determinada pelo método de Bradford, utilizando o kit Bradford Protein Assay (BioRad). A atividade enzimática foi determinada através de método espectrofotométrico utilizando o-nitrofenol-β-D-galactopiranoside (ONPG) como substrato. A maior atividade enzimática específica foi de 39,13 ± 2,30 U/mg_proteína, obtida utilizando lactose como indutor na concentração de 10 g/L, após 27 h de indução. Não foi verificada diferença significativa nos valores de atividade quando utilizado lactose como indutor, nas concentrações de 10 e 20 g/L, a partir de 6 h de cultivo. Quando utilizado IPTG como indutor verificou-se uma menor atividade específica. Este resultado demonstra a possibilidade de utilizar um indutor de menor custo e com baixa toxicidade.