A enzima β-galactosidase catalisa a hidrólise da lactose em glicose e galactose. Esta enzima apresenta grande interesse para a indústria de laticínios e farmacêutica, sendo utilizada na preparação de produtos para indivíduos intolerantes à lactose. A β-galactosidase pode ser obtida de forma recombinante, possibilitando a inserção de uma cauda de poli(histidina) a região C ou N-terminal da sequência da mesma, promovendo à purificação da proteína por meio de coluna cromatográfica de afinidade por íon metálico imobilizado (IMAC). Com isso, o objetivo deste trabalho foi avaliar a eficiência da purificação da enzima β-galactosidase de Kluyveromyces sp. com cauda de histidina. Células de E. coli BL21(DE3) foram transformadas com o gene da β-galactosidase de Kluyveromyces sp., contendo cauda de histidina na região N-terminal e mantidas em 40% de glicerol a -20°C. Foram realizados cultivos em Erlenmeyer de 2 L, contendo 500 mL de meio de cultivo LB, 50 μg/mL canamicina e 10% de pré-inóculo padronizado com densidade óptica (OD) de 0,1 a 600 nm, mantidos em agitação orbital de 180 rpm a 30ºC. Os cultivos foram induzidos com 10 g/L de lactose. Após 24 h, as células foram separadas por centrifugação, ressuspendidas em tampão Tris/HCl 50 mM pH 7,5, rompidas utilizando Prensa de French com pressão de 30 kpsi e novamente centrifugadas (4º C, 18.000 rpm, por 30 minutos) para a separação da fração solúvel que foi dialisada em tampão de ligação. Dois protocolos de purificação foram testados: o primeiro utilizando a resina His-Trap HP (GE-HealthCare), em sistema ÄKTA Purifier, com um gradiente de eluição de 0 a 125 mM de Imidazol; o segundo, a resina Ni-NTA Agarose (Qiagen) em batelada utilizando 50 e 100 mM de Imidazol. A avaliação dos protocolos foi determinada por: SDS-PAGE (12%), concentração proteica pelo método de Bradford, atividade enzimática utilizando um método espectrofotométrico com o-nitrofenol-β-D-galactopiranosideo (ONPG) e presença de DNA do hospedeiro (E. coli) utilizando a técnica de 16S. A purificação da β-galactosidase ocorreu de forma parcial e a ausência de DNA do hospedeiro foi verificada nos dois protocolos testados. A atividade específica da β-galactosidase após a purificação foi de 8,4 U/mg_proteína e 94,3 U/mg_proteína, para o primeiro e para o segundo protocolo testados, respectivamente. Os resultados obtidos demonstraram a eficiência da interação entre a cauda de poli(histidina) presente na enzima recombinante e os suportes IMAC testados, orientando o estudo de novos suportes visando a purificação e imobilização da β-galactosidase em uma única etapa.